摘要：以紫紅曲霉、葡萄牙棒孢酵母、己酸菌為實驗對象復(fù)配一種多菌種酯化酶，利用正交試驗設(shè)計，選出酯化力最高的配比方案：紫紅曲霉菌種60%，葡萄牙棒孢酵母20%，己酸菌菌種20%。以此配比制作的麩曲與大曲按比例投入到濃香型白酒的生產(chǎn)中，考察不同曲用量比例的實驗窖池，對其出酒率、原酒的理化指標(biāo)和感官質(zhì)量進行綜合分析，得到最優(yōu)的曲用量比例：大曲21.5%、復(fù)合酯化酶菌種麩曲1.5%。

關(guān)鍵詞：酯化酶；紫紅曲霉；葡萄牙棒孢酵母；己酸菌；正交實驗；濃香型白酒

青島瑯琊臺集團股份有限公司 徐宗喜 趙詠偉 晁進福 徐廣祥 辛躍強 柳邦向 陳燊君

白酒是我國傳統(tǒng)的蒸餾酒，擁有數(shù)千年的釀造歷史，也是中華文明的重要組成部分。在感官上，國外蒸餾酒以醇香為主，中國白酒則是以酯香為主，其中，濃香型白酒的主體呈香物質(zhì)是己酸乙酯，其含量及與其他乙酯的量比關(guān)系決定了濃香型白酒的品質(zhì)和風(fēng)格¹。經(jīng)過長期的生產(chǎn)實踐和研究表明，濃香型白酒中己酸乙酯和乳酸乙酯比例控制在1∶（0.5-0.8）²，能使主體香突出，香、味協(xié)調(diào)，酒體典型性強。然而目前，濃香型白酒企業(yè)多存在原酒中己酸乙酯含量不足、乳酸乙酯含量偏高的現(xiàn)象，嚴(yán)重影響了白酒的品質(zhì)。因此，增己降乳成為提高濃香型白酒品質(zhì)的重要課題。

目前，增己降乳的研究比較多，主要技術(shù)措施有³-[5]：己酸菌與其他菌種混合培養(yǎng)、回酒發(fā)酵、雙輪底發(fā)酵、酯化酶增香技術(shù)、復(fù)合酯化酶生態(tài)菌劑的應(yīng)用等。其中，紫紅曲霉、葡萄牙棒孢酵母以及己酸菌對提升濃香型白酒中的己酸乙酯含量具有非常積極的作用，并且混合菌劑中的微生物相互作用可以激發(fā)更高的生物活性和酯化能力。所以，本文以紫紅曲霉、葡萄牙棒孢酵母、己酸菌為研究對象，通過正交實驗找到三種菌種最佳復(fù)配比例，制作一種高酯化力的復(fù)合菌劑，并應(yīng)用到濃香型白酒的生產(chǎn)中，以期提高原酒的出酒率和品質(zhì)。

1.材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌種與大曲

紫紅曲霉、葡萄牙棒孢酵母、己酸菌、大曲。

1.1.2主要試劑

葡萄糖、蔗糖、蛋白胨、瓊脂粉、乙酸鈉、硝酸鈉、硫酸銨、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鉀、硫酸亞鐵、碳酸鈣、氫氧化鈉、鹽酸、酚酞試劑、乙醇、乳酸、酵母浸粉、酵母膏。

1.1.3培養(yǎng)基

YPD培養(yǎng)基：葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母浸粉1%，自然pH；

乙酸鈉培養(yǎng)基：乙酸鈉0.5%、酵母膏0.1%、硫酸鎂0.02%、磷酸氫二鉀0.04%、硫酸銨0.05%、碳酸鈣1%、乙醇2%（培養(yǎng)基滅菌后再添加）、pH6.5、瓊脂粉1.5%～2%；

查氏培養(yǎng)基：蔗糖3%、硝酸鈉0.3%、磷酸氫二鉀0.1%、氯化鉀0.05%、硫酸鎂0.05%、硫酸亞鐵0.001%、pH7.2-7.4、瓊脂粉1.5%。

1.2主要儀器與設(shè)備

滅菌鍋、超凈工作臺、恒溫震蕩搖床、恒溫培養(yǎng)箱、ISO-9001電子分析天平、CJPF-J30酒精計、Agilent7890B氣色譜儀、電熱鼓風(fēng)干燥箱。

1.3實驗方法

1.3.1菌種活化

1.3.1.1葡萄牙棒孢酵母菌種活化

將葡萄牙棒孢酵母凍干粉接種至10mL YPD液體培養(yǎng)基中，200r/min 30℃培養(yǎng)12h后，涂布平板，30℃培養(yǎng)48h后，再挑取單個菌落進行液體培養(yǎng)，鏡檢，選擇細(xì)胞個體均勻的單菌落進行活化培養(yǎng)。

1.3.1.2己酸菌菌種活化

取甘油管保藏己酸菌1支，接種至20mL試管培養(yǎng)基中，35℃厭氧培養(yǎng)6天，在乙酸鈉固體培養(yǎng)基中涂平板，37℃培養(yǎng)7d后，挑取單個菌落進行液體培養(yǎng)。將活化好的己酸菌以10%的接種量依次接種至100mL液體培養(yǎng)基、1L液體培養(yǎng)基、3L液體培養(yǎng)基、20L卡氏罐中，35℃厭氧各培養(yǎng)6天。

1.3.1.3紫紅曲霉菌種活化

取斜面保藏的紫紅曲霉，接種至10mL查氏液體培養(yǎng)基中，32℃培養(yǎng)48h，在固體培養(yǎng)基中涂平板，32℃培養(yǎng)5d后，挑取單個菌落進行液體培養(yǎng)，鏡檢，選擇菌落大小均勻的單菌落依次接種至10mL、100mL液體培養(yǎng)基中進行活化培養(yǎng)。

1.3.2復(fù)合酯化酶菌種的優(yōu)化

利用正交實驗設(shè)計，將紫紅曲霉、葡萄牙棒孢酵母、己酸菌三種菌種按不同比例接種到麥麩培養(yǎng)基中，制作成多菌種酯化酶麩曲，以酯化力大小作為評價指標(biāo)，獲得最優(yōu)配比。

1.3.2.1正交實驗設(shè)計

確定紫紅曲霉菌種比例（A）、葡萄牙棒孢酵母菌種比例（B）、己酸菌菌種比例（C），按L_9（3）^3表進行三因素三水平正交試驗設(shè)計，正交試驗設(shè)計的因素水平表見表1。

1.3.2.2多菌種酯化酶麩曲制作工藝見圖1

1.3.2.3酯化力的測定方法

稱取5g干曲的曲量，加入100mL含3%己酸、5%vol乙醇的酯化體系中,30℃酯化100h，加水50mL蒸餾，接餾出液100mL，最后用氣相色譜檢測反應(yīng)體系中形成的己酸乙酯含量。酯化力定義為每100mL餾出液中含己酸乙酯毫克數(shù)。數(shù)值最大者即為實驗中的最佳菌種配比方案，以此菌種配比方案制作的麩曲繼續(xù)后續(xù)大生產(chǎn)應(yīng)用實驗。

1.3.3復(fù)合酯化酶菌種麩曲與大曲在濃香型白酒生產(chǎn)中配比的優(yōu)化

利用前期實驗中酯化力最高的菌種配比方案制得的麩曲與大曲，按不同比例投入酒醅入池發(fā)酵，其他釀造條件保持一致。配比方案見表2。

2.結(jié)果與分析

2.1正交試驗結(jié)果與分析

按L_9（3）^3設(shè)計的正交試驗結(jié)果與分析可知：（1）對酯化力影響的因素依次為A＞C＞B，說明紫紅曲霉在復(fù)合菌系中是優(yōu)勢菌種，其酯化力最強以及其比例大小對復(fù)合菌種的酯化力影響最大；（2）最優(yōu)組合是A3B2C2，即本實驗的多菌種酯化酶的最優(yōu)配比為紫紅曲霉菌種60%，葡萄牙棒孢酵母菌種20%，己酸菌菌種20%。

2.2實驗窖池原酒的主要理化指標(biāo)、出酒率及感官評價結(jié)果分析

統(tǒng)計三輪實驗窖池的出酒率、理化指標(biāo)、感官品評結(jié)果見表3。

由表3可知：（1）與方案一（對照組）相比，實驗組的原酒主要風(fēng)味成分隨著復(fù)合酯化酶菌種麩曲使用比例的提高而提高。不過，當(dāng)麩曲使用量超過2%時，己酸乙酯含量有所下降，并且乙酸乙酯的含量過高，原因可能是復(fù)合菌種對乳酸菌具有抑制作用并對乙酸乙酯的合成也具有積極作用；（2）感官評價得分大小順序為方案4＞方案3＞方案2＞方案5＞方案1，即原酒品質(zhì)隨著復(fù)合酯化酶菌種麩曲使用比例的提高而提高，但當(dāng)麩曲使用量超過2%時，酒質(zhì)會下降。所以，結(jié)合出酒率和感官評價得分可知，最優(yōu)曲用量配比為大曲21.5%和麩曲1.5%。

3.結(jié)論

通過優(yōu)化酯化酶功能菌種的配比，能夠有效提升復(fù)合菌種的生物活性和酯化力。

濃香型白酒的生產(chǎn)過程是多菌種相互作用且開放式的復(fù)雜發(fā)酵體系，數(shù)量難以控制，量比關(guān)系不固定等缺陷使得酒質(zhì)不穩(wěn)定。而多菌種酯化酶由于是人為控制合成的生態(tài)菌劑，主要功能微生物數(shù)量足、功能強、量比關(guān)系穩(wěn)定，能夠彌補生產(chǎn)中的不足，突出了己酸乙酯的主體香，使得酒體豐滿協(xié)調(diào)，提高了原酒的質(zhì)量。

多菌種酯化酶在濃香型白酒生產(chǎn)中的使用量并非越多越好，本實驗中發(fā)現(xiàn)，其使用量超過2%時，原酒中的乙酸乙酯含量過高，導(dǎo)致主體香不突出，酒體淡薄，酒質(zhì)下降。

參考文獻：

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